1 冷凍管應(yīng)如何解凍？取出冷凍管后，須立即放入 37 C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。

2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有 10-15ml 新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。

3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活。

5 何謂 FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用 5 %或 10% CO2？或根本沒有影響？一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中 NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的 CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 含量為每公升 3.7 g 時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用 10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 為每公升 1.5 g 時，則應(yīng)使用 5% CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

7 何時須更換培養(yǎng)基？視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。

8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

9 附著性細(xì)胞繼代時所使用之 trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？一般使用之 trypsin-EDTA 濃度為 0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4Na。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20 C，避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 之活性降低，并可減少污染之機會。

10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。

11 欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？欲回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為 300xg (約1,000rpm)，5 - 10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

12 細(xì)胞之接種密度為何？依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。

13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？動物細(xì)胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5 - 10% DMSO(dimethyl sulfoxide) 和 90 - 95 %原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于 DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將 DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。

14 DMSO之等級和無菌過濾之方式為何？冷凍保存使用之 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 之 DMSO(如 Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 C，避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機會。若要過濾 DMSO，則須使用耐DMSO 之 Nylon 材質(zhì)濾膜。

15 冷凍保存細(xì)胞之方法？冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 C 30~60 分鐘 → (-20 C 30 分鐘) → -80 C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽 vapor phase 長期儲存。冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降 1-3 C 至–80 C 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。*-20 C 不可超過 1 小時，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80 C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

16 細(xì)胞欲冷凍保存時，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的好方法。

18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理？加入相應(yīng)抗生素，直接滅菌后丟棄之。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。

20 支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)，代謝及研究任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實驗前，必須確認(rèn)細(xì)胞為 mycoplasma-free，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

21 偵測出細(xì)胞株有支原體污染時， 該如何處理？直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。

22 CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

23 為何培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性，而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾之CO2，以調(diào)整pH 值。

24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的 dish，flask 是否均相同？不同廠牌的 dish 或 flask，其所 coating 的 polymer 不同，制造程序亦不同，雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之 dish 或 flask 而有顯著之生長差異。

25 購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

26 購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細(xì)胞置于–80℃太久。

27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

28 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM 或M199 中同樣很容易生長?？傊?， MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)可選 AIMV（12005）培養(yǎng)基（SFM）。

29 L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

30 GlutaMAX-I 是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用 GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？GlutaMAX-I二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用 L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎降解完成。

31 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

32 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

33 目錄上說，Hank’s平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和 Earle’s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？HBS和EBS的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在 Hanks (0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的 PH 值。Eagles 液在空氣水平的CO2中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用 Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

34 二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

35 當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的 50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。

36 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

37 大部分添加物和試劑最多可以凍融 3 次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

38 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在 4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過 30 分鐘，就會變得不穩(wěn)定。

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