一、細胞解凍方法：

準備一個培養(yǎng)培養(yǎng)瓶，使其包含產(chǎn)品說明書中列出的推薦體積的適當培養(yǎng)基，并針對溫度和 pH (CO 2 )進行平衡。

在 37°C 或該細胞系的正常生長溫度下，在水浴中輕輕攪拌解凍小瓶。解凍應該很快，大約 2 分鐘或直到冰晶融化。

從水浴中取出小瓶，并通過浸入或噴灑 70% 乙醇來凈化。在層流組織培養(yǎng)罩中遵循嚴格的無菌條件進行所有進一步操作。

擰下小瓶的頂部并將內(nèi)容物轉移到含有 9 mL 推薦培養(yǎng)基的無菌離心管中。通過溫和離心（125 × g 10 分鐘）去除冷凍保護劑 (DMSO)。丟棄上清液，將細胞重懸于 1 或 2 mL 培養(yǎng)基中。將細胞懸浮液轉移到含有生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)培養(yǎng)瓶中，并通過輕輕搖動混合。

24 小時后檢查細胞培養(yǎng)物，并根據(jù)需要進行繼代培養(yǎng)。

這里需要注意的是：一些細胞系可能需要幾天時間才能從冷凍保存中恢復。比如：一些雜瘤細胞在培養(yǎng)的第一天活力很差，會產(chǎn)生細胞碎片。解凍后，細胞將開始恢復并進入指數(shù)增長。

二、解凍后的細胞處理：

一些細胞供貨商為保證成活率，會解凍后進行發(fā)貨運輸。這些培養(yǎng)瓶用細胞接種，孵育以確保細胞生長，然后填充培養(yǎng)基以進行運輸。

收到細胞培養(yǎng)物后，需要目視檢查培養(yǎng)基是否存在微生物污染的宏觀證據(jù)。這包括異常的 pH 值變化（酚紅的黃色或紫色）、渾濁或顆粒。使用低倍率 (100×) 的倒置顯微鏡檢查培養(yǎng)基是否存在微生物污染的證據(jù)以及細胞的形態(tài)。

如果細胞貼壁并以單層生長：

• 如果細胞已經(jīng)貼附并形成單層，可能需要維持細胞的生長狀態(tài)和健康狀態(tài)，以便繼續(xù)進行下一步實驗或分析。以下是一些建議來維護單層細胞的生長和健康狀態(tài)：

• 保持培養(yǎng)基的新鮮和適當?shù)臓I養(yǎng)：必須經(jīng)常更換液體培養(yǎng)基，以保持適當?shù)?/span>pH，滲透壓和營養(yǎng)素含量。常用的方式是定期檢查培養(yǎng)基的酸堿度和滴定度，做好消毒和表面清潔，防止細菌、真菌、病毒的交叉感染。

• 檢查和調(diào)整環(huán)境參數(shù)：為了維護細胞的生長狀況，必須保證細胞在適當?shù)沫h(huán)境因素下培養(yǎng)。推薦將細胞培養(yǎng)于CO2孵化器中，溫度保持在37攝氏度下。定期檢查溫度、濕度和氣體氧氣濃度，以便使它們符合細胞類型的要求。

• 定期更換培養(yǎng)基：細胞每一到兩天將需要更換培養(yǎng)基，以便消除可能產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物、細胞分泌物和懸浮物。這還可以幫助保持適當?shù)?/span>pH和離子濃度，并提供營養(yǎng)物質(zhì)來促進細胞增殖和擴增。

• 定期找出并處理細胞培養(yǎng)中的污染：如果發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)中存在污染的跡象，需要立即找出并處理。建議采取逆向染色方法，比如酚紅染色，而不是道理西的吉姆薩染色，以避免影響細胞健康和形態(tài)。處理污染將需要使用抗生素、抗真菌藥物等，但必須謹慎使用，以避免對細胞的毒性和不良影響。

• 監(jiān)測細胞增殖和活性：對于已經(jīng)貼壁并形成單層的細胞，可以使用視覺方式或其他方法監(jiān)測細胞的增殖和活性。例如，可以檢測細胞形態(tài)、顏色和密度，以了解細胞數(shù)量和健康狀態(tài)。建議采用背景熄滅的方法來觀察細胞的數(shù)量和活性，比如MTT、CCK-8等方法。

大多數(shù)細胞系開始于原代培養(yǎng)物，原代培養(yǎng)物來源于一塊切碎的或酶分散的組織。原代培養(yǎng)物作為幾種細胞類型的混合物，保留了它們來源組織的特征。

一段時間后，原代培養(yǎng)物將達到匯合狀態(tài)，即由于細胞擴張而覆蓋培養(yǎng)培養(yǎng)瓶所有可用空間的狀態(tài)。此時，需要將培養(yǎng)物分解（通常使用胰蛋白酶等蛋白水解酶）為單個細胞并進行傳代培養(yǎng)（分裂、傳代或轉移）。在1次傳代之后，培養(yǎng)物通常被稱為細胞系。隨著隨后的每次傳代培養(yǎng)，細胞群變得更加均勻，因為生長更快的細胞占主導地位。也可以通過克隆從培養(yǎng)物中選出具有所需特性的細胞。

二倍體細胞系很少會超過幾次群體倍增。它們的復制能力有限，在 20 到 80 次種群倍增后開始減慢并停止分裂。

有的證據(jù)表明，在細胞培養(yǎng)中觀察到的一些細胞衰老可能是由于不適當?shù)呐囵B(yǎng)條件，而不是預定的復制衰老。

還有其他數(shù)據(jù)支持某些物種（尤其是人類）的細胞即使在改良的培養(yǎng)條件下生長也會出現(xiàn)復制性衰老。這種衰老是由每次細胞分裂時染色體末端（端粒）的縮短介導的。

相反，連續(xù)（或永生化）細胞系具有無限的復制能力。這些細胞系通過多種方式中的任何一種通過永生化或轉化衍生自細胞系。許多連續(xù)細胞系來源于腫瘤組織。 集合中的大多數(shù)細胞系是連續(xù)的，盡管少數(shù)細胞系是有限的，例如 CCD-1117Sk 人皮膚成纖維細胞 (  CRL-2465 ) 或 CCD-18Co 人結腸 (  CRL-1459 )。

 細胞傳代培養(yǎng)步驟：細胞的生長方式主要有兩種，即：貼壁生長和懸浮生長。當細胞在單層或懸浮液中生長和分裂時，它們通常遵循由四個階段組成的特征性生長模式：滯后、對數(shù)或指數(shù)、靜止或平穩(wěn)和下降。

l 停滯期——在培養(yǎng)培養(yǎng)瓶接種后，細胞立即緩慢生長，同時從傳代培養(yǎng)的壓力中恢復過來。

l 對數(shù)或指數(shù)期——細胞進入指數(shù)生長期，一直持續(xù)到整個生長表面被占據(jù)或細胞濃度超過培養(yǎng)基的容量。

l 靜止期——細胞增殖減慢并停止。

l 衰退期——如果不更換培養(yǎng)基且細胞數(shù)量不減少，細胞就會失去活力，數(shù)量也會減少。

l 為確保活力、遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定性，細胞系需要維持在指數(shù)期。這意味著它們需要在進入穩(wěn)定生長期之前、在單層細胞達到 100% 匯合之前或在懸浮液達到其最大推薦細胞密度之前定期進行傳代培養(yǎng)。為每個細胞系生成生長曲線有助于確定細胞系的生長特征。

傳代數(shù)和群體倍增水平

原代培養(yǎng)物通常以 1:2 的比例傳代（每次傳代時將它們分成兩半）。大多數(shù)連續(xù)細胞系以更高的速率復制，并以更高的分流比進行傳代培養(yǎng)。傳代數(shù)通常是細胞傳代培養(yǎng)到新容器中的次數(shù)。對于二倍體培養(yǎng)，傳代數(shù)大致等于自培養(yǎng)開始以來的群體倍增次數(shù)（或群體倍增水平，PDL）。這不是連續(xù)細胞系的情況，因為它們以更高的分流比傳代。因此，PDL 未針對連續(xù)細胞系確定。在大多數(shù)情況下，PDL 是一個估計值，因為它不考慮任何因壞死或細胞凋亡死亡或接近衰老且不再分裂的細胞而丟失的細胞。

PDL = 3.32 (log Xe – log Xb) + S

Xb 是孵育開始時的細胞數(shù)。

Xe 是孵育時間結束時的細胞數(shù)。

S 是起始 PDL。

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